In this study, the presence of Mycobacterium bovis DNA was investigated by Real-Time PCR in 72 tissue samples (36 of which were lymph nodes and 36 were blood samples) from 36 cows, suspected of having bovine tuberculosis, slaughtered at abattoirs in Ankara. M. bovis DNAs were genotyped by spoligotyping method. For this reason, bovine blood and lymph node tissues were spiked with M. bovis AN/5 strain and were used for PCR optimization. PCR optimization was done in Light Cycler (performing Real-Time Fluorescent detection) system. Total PCR time was found to be 40 min. Amplicons were detected to lose their fluorescent densities (in other words they were totally denatured) at 92.176C. This situation was specific for the region specifically amplified by the primers DRa and DRb. PCR sensitivity was determined as 6 cfu/ 2 ul = 3 cfu/ul. 9 M. bovis DNA from 36 lymph nodes out of 72 tissues samples were amplified by PCR and these were detected by ELISA. No amplification was recorded from blood samples. Spoligotyping method was performed in microplates. 43 different oligonucleotides coated in microplate wells were hybridized with 9 PCR amplicons. As a result, 3 different spoligotypes were detected in 9 M. bovis DNA samples
Bu çalışmada, Ankara çevresindeki mezbahalardan toplanan tüberküloz şüpheli 36 sığıra ait 72 doku örneğinde (36 lenf yumrusu ve 36 kan örneği) Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (real-time PCR) ile Mycobacterium bovis DNA’sı arandı ve DNA’lar spoligotiplendirme yöntemi ile genotiplendirildi. Bu amaçla, ilk olarak sığır kan ve lenf yumrusu dokuları Mycobacterium bovis AN/5 suşu ile karıştırılarak PCR optimizasyonu için kullanıldı. PCR Light Cycler (Real-Time Flourescent deteksiyon yapan) sisteminde optimize edildi. Tüm PCR süresi toplam 40 dk olarak belirlendi. Amplikonların 92.176oC’de tamamen ayrıldığı, diğer bir deyişle, fluoresan yoğunluklarını kaybettikleri görüldü. Bu sıcaklık (erime noktası) primerlerin (DRa ve DRb) amplifiye ettiği bölgeye spesifiktir. PCR sensitivitesi 6 cfu/2 μl = 3 cfu/μl olarak belirlendi. Toplam 72 doku öneğinde, 36 lenf yumrusu numunesinden 9 M. bovis DNA’sı PCR ile amplifiye edildi ve ELISA ile gösterildi. Kan numunelerinde herhangi bir amplifikasyon kaydedilemedi. Spoligotiplendirme yöntemi mikropleytlerde uygulandı. Mikropleytlere bağlanan 43 farklı oligonükleotid 9 PCR ürünü ile hibridize edildi. Sonuç olarak 9 M. bovis DNA’sında 3 farklı spoligotip ortaya konuldu
Birincil Dil | Türkçe |
---|---|
Konular | Veteriner Cerrahi |
Bölüm | Araştırma Makalesi |
Yazarlar | |
Yayımlanma Tarihi | 1 Eylül 2007 |
Yayımlandığı Sayı | Yıl 2007Cilt: 54 Sayı: 3 |